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研究紫草素抑制白色念珠菌的材料和方法

日期:2018/11/25 15:02:33 点击次数 1450 发布单位:天义生物谷  录入:李清

1 材料和方法


1.1 材料


1.1.1 菌种: 白色念珠菌(Candida albicans ATCC10231),购自中国医学菌种保藏中心。


1.1.2 培养基与试剂: 沙堡葡萄糖琼脂固体培养基(SDA)、RPM-1640液体培养基和酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YEPD);蛋黄培养基;紫草素标准品购于成都曼斯特股份有限公司。


1.1.3 主要实验仪器设备: 酶标仪(Thermo MULTISKAN ASCENT);PCR仪(英国TTECHNE-512型);实时荧光定量PCR仪(日本TAKARATP800);电泳凝胶定量分析系统(Bio-Rad公司,Version 3.1);扫描电镜(KYKY-1000B);激光共聚焦显微镜(Zeizz LSM 710,German)。


1.2 紫草素对白色念珠菌的抑制作用测定


将200 μL培养至对数期的白色念珠菌的菌悬液(106 CFU/mL)分别加入96孔板中,再加入20μL不同浓度的紫草素药液,使其终浓度分别为64、32、16、8、4μg/mL,37℃培养24h后于595 nm处测定吸光值。以不加药物组为空白对照。实验重复3次,取平均值。其中,紫草素对白色念珠菌的最低抑菌浓度(MIC)值为菌体的OD值下降80%以上的最低药物浓度。从大于MIC的各孔中分别取10μL菌悬液涂布于SDA固体培养基上,37℃培养48h后观察菌体生长情况,最低杀菌浓度(MFC)为平板上没有菌体生长的最低药物浓度。


1.3 紫草素对白色念珠菌细胞膜渗透性的影响


将培养至对数期的菌悬液按2%接种量接种于20mL RPM-1640液体培养基中,以150r/min、30℃恒温培养16h后,离心弃上清液,用PBS洗涤菌体2次,制成适当浓度的白色念珠菌菌悬液,分别向其中加入浓度为MIC和2MIC的紫草素继续培养12h,每隔2h分别取样液4mL,4000r/min离心10min弃沉淀,用紫外分光光度计于260nm下测定上清液中DNA和RNA等大分子物质的变化。以不加药为空白对照组,实验重复3次,取平均值。


1.4 紫草素对白色念珠菌形态的影响


将培养至对数期的白色念珠菌菌悬液(107 CFU/mL)接种于含紫草素终浓度为MIC的YEPD液体培养基中,150r/min、30℃振荡培养。于6h和16h分别取1mL菌悬液,3000r/min离心5min后弃上清。再加入0.5mL PBS缓冲液和0.5mL 2.5%的戊二醛,4℃冰箱固定过夜。次日用PBS缓冲液冲洗2次,50%、80%、100%乙醇依次脱水1次,每次15min,100%乙醇浸没的电镜样品置4℃冰箱中降温10min后,放入真空干燥器中干燥40min。待干燥后的样品温度升至室温后取出,喷金镀膜,使用扫描电镜观察照相,以不加药组为空白对照,实验重复3次。


1.5 紫草素对白色念珠菌细胞内钙离子浓度的影响


将2mL RPM-1640培养基及300μL培养至对数期的菌悬液(106CFU/mL)分别加入6孔板中,每孔内分别放一片无菌盖玻片,37℃培养4h后,以加入300μL浓度为MIC的紫草素的孔为实验组,加入300μL去离子水的孔为空白对照组,37℃下继续培养16h。然后吸出每孔中的液体,用PBS缓冲液洗涤2次。阴干后于避光环境下向每孔中加入1mL 5μmol/L的钙离子荧光探针(Fluo-3AM),于37℃培养箱中孵育45min进行探针装载。吸出剩余的荧光探针染液并用PBS缓冲液冲洗,置于37℃培养箱中继续孵育15min,以确保Fluo-3AM完全转变为Fluo-3。取出盖玻片,用10μL抗荧光淬灭剂进行封片后,利用激光共聚焦显微镜检测荧光强度,并按照公式(1)计算钙离子浓度([Ca2+])变化百分率。实验重复3次。




1.6 紫草素对白色念珠菌分泌胞外磷脂酶(phosphlipase,PL)的影响


制备10μL含紫草素终浓度为1/2MIC和MIC的菌悬液(106 CFU/mL)并用移液枪接种于卵黄培养基上,以加等量PBS的菌悬液为空白对照,于37℃下培养48h。待培养结束后,用刻度尺分别测量平板上的菌落直径和沉淀圈直径,每组实验重复3次,取平均值。磷脂酶的活性用PZ值表示,PZ值按下列公式计算。PZ值=菌落直径/总直径。总直径=菌落直径+菌落周围沉淀圈的直径。PZ=1,表示无磷脂酶活性;PZ值<1,表示有磷脂酶活性,且PZ值越大,磷脂酶的活性越弱。


1.7 紫草素对白色念珠菌PLB1和PLB2相对表达量的影响


1.7.1 白色念珠菌PLB1和PLB2基因的检测: 提取模板DNA,根据GenBank中已发布的白色念珠菌的基因序列,利用Primer 5.0软件及参考文献设计磷脂酶相关基因PLB1和PLB2的上下游引物,琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。PCR扩增条件为94℃ 5min;94℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 45s,30个循环;72℃ 10min。


1.7.2 紫草素对白色念珠菌PLB1和PLB2相对表达量的影响: 将培养至对数期的菌悬液接种到含紫草素终浓度分别为1/8 MIC、1/4 MIC和1/2 MIC的RPM-1640培养基中,30℃、150 r/min培养16h后,采用Trizol法提取RNA,用微量核酸测量仪进行RNA浓度的定量。采用2步法反转合成模板cDNA,根据设计合成RT-PCR引物进行扩增。以18SrRNA为内参基因,以不加药物组为空白对照。待反应结束后分析RT-PCR的扩增曲线和融解曲线,并计算PLB1和PLB2基因的相对表达量。


1.8 统计学方法


采用SPSS 17.0及Curve Expert 1.3统计软件进行分析,数值用均数±标准差(x±s)表示。予以卡方检验和t检验。以P<0.05为具有统计学意义。

 
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